En este método, se usan polimerasas diseñadas por la empresa y nucleótidos fluorescentes y de terminador reversible. Las hebras de ADN y los primers se pegan a un portaobjetos, y se lleva a cabo una amplificación por la polimerasa, de forma que se crean colonias locales de ADN o "clusters de ADN". Tras eso se usan las cuatro tipos de bases nucleotídicas de terminador reversible (bases RT), de forma que cuando una de ellas se una a la secuencia se pare la reacción. Una cámara recoge la fluorescencia etiquetada de los nucleótidos, y determinará qué nucleótido es el que se ha unido en esa posición. Aquellos nucleótidos que no se hallan unido serán lavados para continuar con el ciclo: una vez que se ha identificado la primera base y se hayan lavado las demás, se eliminará el terminal de bloqueo del extremo 3' que impedía continuar con la síntesis de la cadena. Se vuelve a echar una nueva tanda de nucleótidos y se continúa la secuenciación hasta completar toda la cadena de ADN. A diferencia de la pirosecuenciación, por cada ciclo se incorpora un único nucleótido, lo que ofrece ventajas como poder tomar las imágenes de forma retrasada y secuencialmente desde una única cámara.
Más información en : Secuenciación de ADN.
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